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降落式PCR 101

之前的文章中,小编简介过各种进阶版的PCR(详情点这里 ),也详说了两种进阶PCR:colony PCR nested PCR 。本期我们就来说说,另外一种进阶版PCR,降落式PCR (Touch-Down PCR,a.k.a. TD-PCR)。

 为什么

看到Touch-Down ,就自然联想到飞机降落的过程,应该是平稳而有序,而不是忽上忽下的。那么降落式PCR就是退火温度逐循环降落的PCR。我们都知道引物的退火温度不仅仅是由引物序列决定的,不同的DNA聚合酶,不同的缓冲液都有可能影响到引物的在反应中的实际退火温度,所以根据引物序列计算出来的退火温度只是一个估测值而已。同时,我们也知道,较高的退火温度会增加引物与母板特异性结合的强度,即更有效地复制出我们想要的序列。也就是说,先使用较高的退火温度,然后退火温度持续下降直到估测值的过程,相当于是富集有效复制母板的过程。

 怎么做

简单来说就两个阶段,详情请参见natural protocol [1]:

  1. 降温阶段。其实退火温度一般设定为(估测Tm + 10)°C,随后每完成一个循环,退火温度降低1 °C,这样持续10个循环,直到退火温度降低为估测Tm。
  2. 恒温阶段。退火温度保持为估测值Tm不变,继续进行20-25个循环,直到整个PCR结束。

注:在降温阶段,遵循每1-3个循环降低1-3°C即可,如果没一个循环降低一度的模式并不能给出显著的扩增结果,可以尝试不同的降温方式,但宗旨都是在10-15个循环内,将退火温度降低到估测Tm。

 Extra tips

  1. 所有反应混合液置于冰上,直到PCR机的热循环已经启动,并且达到所需温度。
  2. 总PCR循环少于35为好,过多的循环总会导致各种非特异性结合。
  3. 如果母板GC含量过高,可以采用更长的变性时间。

 Reference

[1] Nature Protocol: Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification, http://www.nature.com/nprot/journal/v3/n9/full/nprot.2008.133.html

关于降落式PCR有什么心得,欢迎在下方留言讨论哦~

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作者: 卢阳

伦敦大学学院博士,研究方向为生物催化和细胞色素P450开发;BioEngX创始人之一。知乎主页:簏岩。



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