您的位置 首页 化学生物学

Nuture | 一种具有非标准有机催化机制的酶的设计和进化

2019年6月,曼彻斯特大学生物技术研究所Anthony P. Green团队在Nuture上发表了题为“Design and evolution of an enzyme with a non-canonical organocatalytic mechanism”的文章,展示了一种具有非标准有机催化机制的酶的设计和进化过程。

设计具有类似于自然界中发现的复杂催化机制的水解酶是一项艰巨的挑战。天然水解酶通常使用含有活化亲核试剂和氢键供体的催化三联体,以稳定氧阴离子中间体。尽管计算方法能够准确设计组氨酸、半胱氨酸和丝氨酸亲核试剂,但非反应性酰基酶中间体的形成损害了催化功能,水解酶的合成模拟物和源自合成肽的自组装α-螺旋桶也受到类似的限制。为创建一个功能性水解酶,作者选择了David Baker团队此前为Morita–Baylis–Hillman(森田-贝里斯-希尔曼)反应计算设计的酶BH32(图1)作为催化重塑的模板。BH32是通过Rosetta软件设计的并引入了12个活性位点突变,将组氨酸亲核试剂(His23)嵌入到来源于超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii的卤酸脱卤酶中所得到的酶。

图1 BH32示意图

作者首先评估了BH32对一系列单酰化荧光素衍生物的水解活性。如图2所示,催化水解荧光素2-苯乙酸酯,并于500 nm下测定荧光素产物吸收值。与先前设计的酯水解催化剂一致,反应概况(产物随时间的生成)呈现双相行为,反应初期产物的快速积累与酶的快速酰化相关,随后是缓慢的水解转化。His23Ala的突变消除了产物快速积累的阶段,这说明酰化是通过设计的His23亲核试剂进行的。在最初的爆发之后,BH32的底物水解速率与His23Ala变体和背景化学水解速率没有区别。这些结果表明,His23-酰基中间体是稳定且耐水解的,也因此削弱了BH32的催化功能。

图2  含亲核性His23和Me-His23残基的BH32的表征

为了进一步了解反应机理,作者使用抑制剂2-溴苯乙酮将BH32烷基化,得到酰基酶中间体的结构类似物,并通过分析晶体结构发现亲核组氨酸确实通过Nε原子反应(图3)。作者认为BH32 在酯水解过程中积累的酰基咪唑中间体的稳定性可能是由于非配位的Nδ原子在酰化后失去一个质子而呈电中性所致,并假设用非标准的N δ-甲基组氨酸(Me-His)亲核试剂替换His23可以生成一个反应性更强的酰基酶中间体。随后使用工程化的吡咯赖氨酰-tRNA 合成酶与吡咯赖氨酰-tRNA来引入Me-His23残基,这使得水解转化率显著增加,即提供了一种通过非经典有机催化机制起作用的功能性酯酶OE1。这一结果支持了作者的假设:生成反应性更强的酰基酶中间体能够提高水解酶的转化率。

图3  受2-溴苯乙酮抑制BH32的结构表征

作者进一步对OE1进行实验室进化。所使用的进化策略包括局部和全局突变:先使用组合活性位点饱和突变(CASTing)来靶向活性位点残基,包括那些靠近亲核试剂的残基;然后利用易错PCR靶向整个基因,从而识别出“热点”。然后选择21个残基,并通过饱和突变单独随机分组,最终得到OE1.3,其催化效率(kcat/KM)是OE1的15倍,是溶液中游离Me-His的9000倍以上,比常用的有机催化剂二甲氨基吡啶(DMAP)的效率高约2800倍。OE1.3水解荧光素2-苯乙酸酯的反应过程曲线是线性的。用丙氨酸(OE1.3(Me-His23Ala))或组氨酸(OE1.3(Me-His23His))取代Me-His23亲核试剂会有效地消除该酶的水解活性,这表明其催化功能严格依赖于非标准氨基酸的存在。

图4  OE1.3的进化与表征

为深入了解酶活提高的原理,作者分析了OE1和OE1.3的晶体结构(图5)。Me-His的甲基延伸到蛋白质内的一个小口袋中,被残基Ile26、Met27、Leu42、Tyr45和Phe87的侧链所包围。与OE1相比,OE1.3在Me-His咪唑环平面上出现了约15度的小旋转。Ala19His和Ser22Met突变分别位于环平面的上方和下方,降低了Me-His的旋转自由度。Asn46的酰胺侧链与两个水分子形成氢键,使它们靠近Me-His23和His19。这与Tyr45的酚侧链结合,形成了一个极性相互作用网络,其可能在反应中的质子转移和/或水传递中发挥作用。此外,引入的最后一个突变(Leu10Pro),使kcat增加了3倍,该突变扩大了活性位点口袋,诱导了蛋白的主链重排,从Phe7延伸到Leu13。

图5  OE1与OE1.3的晶体结构

作者接下来评估了OE1和OE1.3对一系列荧光素酯的活性(编号2-6)。具有供电子(2)和吸电子(3)苯基取代基、杂环(4和6)和空间要求高的萘基(5)的底物都具有良好的耐受性。然而,与非手性底物相比,α-甲基取代基(R)-7和(S)-7的引入导致酶活性显著降低。为了证明设计的水解酶能够促进对映选择性转化,作者对OE1.3进行了进一步的研究。对荧光素(R)-2-苯丙酸酯((R)-7)的活性进行筛选,筛选出OE1.4,该变体优先水解(R)-7,比其对(S)-对映体的活性高8倍,与母模板OE1.3相比,提高了15倍。突变聚集在前一轮进化中的Pro10周围。这表明,该人工酶可以通过安装相对较少数量的突变,很容易地适应执行新功能。

图6  OE1.3的底物多样性和OE1.4的对映体选择性

综上所述,作者利用扩展的遗传密码获得了一种通过非标准有机催化机制运作的酶。通过细胞翻译机制直接引入反应性亲核试剂使人们能够通过实验室进化优化酶的性能。该研究将促进蛋白质内非标准氨基酸引入技术的发展,以编码具有不同反应模式的功能氨基酸新家族。将这种“受化学启发的”催化功能集成到计算设计算法中,将提供一个强大且通用的策略,以生成具有自然界无法获得的功能的酶。

论文链接:https://doi.org/10.1038/s41586-019-1262-8



回复 Hythuw 取消回复

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注

评论列表(223)

  1. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Смотрите также – http://poisk.cerkov.ru/catalog/region/138

  2. В этой статье вы найдете познавательную и занимательную информацию, которая поможет вам лучше понять мир вокруг. Мы собрали интересные данные, которые вдохновляют на размышления и побуждают к действиям. Открывайте новую информацию и получайте удовольствие от чтения!
    Смотрите также… – https://www.citadelhealth.com/the-one-question-every-business-owner-must-be-able-to-answer-correctly

  3. Эта публикация завернет вас в вихрь увлекательного контента, сбрасывая стереотипы и открывая двери к новым идеям. Каждый абзац станет для вас открытием, полным ярких примеров и впечатляющих достижений. Подготовьтесь быть вовлеченными и удивленными каждый раз, когда продолжите читать.
    Расширить кругозор по теме – https://volleymsk.ru/forum/viewtopic.php?t=4744&start=30

  4. Выбор помощи на дому имеет ряд значительных преимуществ:
    Подробнее тут – [url=https://vyvod-iz-zapoya-tula0.ru/]вывод из запоя в стационаре тула[/url]

  5. Публикация приглашает вас исследовать неизведанное — от древних тайн до современных достижений науки. Вы узнаете, как случайные находки превращались в революции, а смелые мысли — в новые эры человеческого прогресса.
    Почему это важно? – https://noodlebowltbay.com/menus/meatloaf-with-black-pepper-honey-bbq-sauce

  6. Этот информационный материал собраны данные, которые помогут лучше понять текущие тенденции и процессы в различных сферах жизни. Мы предоставляем четкий анализ, графики и примеры, чтобы информация была не только понятной, но и практичной для принятия решений.
    Что ещё нужно знать? – http://russianicons.ru/order.php?obj=46

  7. В этом информативном тексте представлены захватывающие события и факты, которые заставят вас задуматься. Мы обращаем внимание на важные моменты, которые часто остаются незамеченными, и предлагаем новые перспективы на привычные вещи. Подготовьтесь к тому, чтобы быть поглощенным увлекательными рассказами!
    Нажми и узнай всё – https://bestselection.site/gemstonebracelet/powerstonekoukaatta

  8. Этот информативный текст отличается привлекательным содержанием и актуальными данными. Мы предлагаем читателям взглянуть на привычные вещи под новым углом, предоставляя интересный и доступный материал. Получите удовольствие от чтения и расширьте кругозор!
    Все материалы собраны здесь – http://www.wushuvl.ru

  9. Этот информационный материал собраны данные, которые помогут лучше понять текущие тенденции и процессы в различных сферах жизни. Мы предоставляем четкий анализ, графики и примеры, чтобы информация была не только понятной, но и практичной для принятия решений.
    Не пропусти важное – https://www.eu-los.eu/hello-world

  10. В этой статье представлен занимательный и актуальный контент, который заставит вас задуматься. Мы обсуждаем насущные вопросы и проблемы, а также освещаем истории, которые вдохновляют на действия и изменения. Узнайте, что стоит за событиями нашего времени!
    Только для своих – https://topic.lk/7740

  11. В этом интересном тексте собраны обширные сведения, которые помогут вам понять различные аспекты обсуждаемой темы. Мы разбираем детали и факты, делая акцент на важности каждого элемента. Не упустите возможность расширить свои знания и взглянуть на мир по-новому!
    Узнать больше – https://vistoweekly.com/boston-roll

  12. В этой статье представлен занимательный и актуальный контент, который заставит вас задуматься. Мы обсуждаем насущные вопросы и проблемы, а также освещаем истории, которые вдохновляют на действия и изменения. Узнайте, что стоит за событиями нашего времени!
    Что ещё? Расскажи всё! – http://tombengtson.com/blog/?p=194

  13. Этот информативный текст отличается привлекательным содержанием и актуальными данными. Мы предлагаем читателям взглянуть на привычные вещи под новым углом, предоставляя интересный и доступный материал. Получите удовольствие от чтения и расширьте кругозор!
    Узнать напрямую – https://thebackpackersworld.com/hello-world

  14. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Доступ к полной версии – https://saigonland24h.com/charm-resort-long-hai/mat-bang-tang-2-can-ho-charm-resort-long-hai

  15. Этот информативный текст выделяется своими захватывающими аспектами, которые делают сложные темы доступными и понятными. Мы стремимся предложить читателям глубину знаний вместе с разнообразием интересных фактов. Откройте новые горизонты и развивайте свои способности познавать мир!
    Получить дополнительные сведения – https://internacao.com/clinica_de_recuperacao_gratuita

  16. Эта информационная заметка содержит увлекательные сведения, которые могут вас удивить! Мы собрали интересные факты, которые сделают вашу жизнь ярче и полнее. Узнайте нечто новое о привычных аспектах повседневности и откройте для себя удивительный мир информации.
    Что ещё? Расскажи всё! – https://www.acehpakej.com/product/3-days-2-nights-banda-acheh-package

  17. Этот информационный материал собраны данные, которые помогут лучше понять текущие тенденции и процессы в различных сферах жизни. Мы предоставляем четкий анализ, графики и примеры, чтобы информация была не только понятной, но и практичной для принятия решений.
    Получить полную информацию – https://bilitoor.com/introducing-this-amazing-tour

  18. Эта статья предлагает уникальную подборку занимательных фактов и необычных историй, которые вы, возможно, не знали. Мы постараемся вдохновить ваше воображение и разнообразить ваш кругозор, погружая вас в мир, полный интересных открытий. Читайте и открывайте для себя новое!
    Получить больше информации – https://expertmortgageinc.com/integrated-reporting-leading-practices-international-developments-4

  19. Мы предлагаем вам подробное руководство, основанное на проверенных источниках и реальных примерах. Каждая часть публикации направлена на то, чтобы помочь вам разобраться в сложных вопросах и применить знания на практике.
    Лучшее решение — прямо здесь – https://www.thaimisdelicias.net/product/stir-fry-pearl-noodles

  20. Этот информативный текст выделяется своими захватывающими аспектами, которые делают сложные темы доступными и понятными. Мы стремимся предложить читателям глубину знаний вместе с разнообразием интересных фактов. Откройте новые горизонты и развивайте свои способности познавать мир!
    Ознакомьтесь с аналитикой – https://lamat.pl/2023/04/11/personal-and-group-lessons-adapted-to-your-level-on-each-class

  21. Эта информационная статья содержит полезные факты, советы и рекомендации, которые помогут вам быть в курсе последних тенденций и изменений в выбранной области. Материал составлен так, чтобы быть полезным и понятным каждому.
    Доступ к полной версии – https://cgdesignstyle.ru

  22. Предлагаем вашему вниманию интересную справочную статью, в которой собраны ключевые моменты и нюансы по актуальным вопросам. Эта информация будет полезна как для профессионалов, так и для тех, кто только начинает изучать тему. Узнайте ответы на важные вопросы и расширьте свои знания!
    Смотри, что ещё есть – http://iflight.ltd/2024/03/29/hello-world

  23. Эта информационная заметка содержит увлекательные сведения, которые могут вас удивить! Мы собрали интересные факты, которые сделают вашу жизнь ярче и полнее. Узнайте нечто новое о привычных аспектах повседневности и откройте для себя удивительный мир информации.
    Подробная информация доступна по запросу – https://www.christopherdiarte.com/uncategorized/the-lost-secret-of-chemistry-laboratory

  24. Этот информативный текст выделяется своими захватывающими аспектами, которые делают сложные темы доступными и понятными. Мы стремимся предложить читателям глубину знаний вместе с разнообразием интересных фактов. Откройте новые горизонты и развивайте свои способности познавать мир!
    Переходите по ссылке ниже – https://www.dtfx.ru/monetize-proactive-your-e-business-access-to-accurate-experiences

  25. Публикация приглашает вас исследовать неизведанное — от древних тайн до современных достижений науки. Вы узнаете, как случайные находки превращались в революции, а смелые мысли — в новые эры человеческого прогресса.
    Уточнить детали – https://f5fashion.vn/top-hon-70-ve-set-vest-moi-nhat

  26. Эта статья предлагает живое освещение актуальной темы с множеством интересных фактов. Мы рассмотрим ключевые моменты, которые делают данную тему важной и актуальной. Подготовьтесь к насыщенному путешествию по неизвестным аспектам и узнайте больше о значимых событиях.
    Перейти к статье – https://3d-area.ru/?paged=12

  27. Эта публикация завернет вас в вихрь увлекательного контента, сбрасывая стереотипы и открывая двери к новым идеям. Каждый абзац станет для вас открытием, полным ярких примеров и впечатляющих достижений. Подготовьтесь быть вовлеченными и удивленными каждый раз, когда продолжите читать.
    Расширить кругозор по теме – https://aemtk.ru/?paged=23

  28. Эта информационная заметка содержит увлекательные сведения, которые могут вас удивить! Мы собрали интересные факты, которые сделают вашу жизнь ярче и полнее. Узнайте нечто новое о привычных аспектах повседневности и откройте для себя удивительный мир информации.
    Только для своих – https://farmnetwork.com.tr/kuresel-isinma-meksikanin-dunyaca-unlu-aci-biberi-poblanoyu-tehdit-ediyor

  29. Этот информативный текст отличается привлекательным содержанием и актуальными данными. Мы предлагаем читателям взглянуть на привычные вещи под новым углом, предоставляя интересный и доступный материал. Получите удовольствие от чтения и расширьте кругозор!
    Ознакомьтесь с аналитикой – http://emiliasimandy.com/bonjour-tout-le-monde

  30. Публикация приглашает вас исследовать неизведанное — от древних тайн до современных достижений науки. Вы узнаете, как случайные находки превращались в революции, а смелые мысли — в новые эры человеческого прогресса.
    Почему это важно? – http://www.dancing-dragonflies.de/hallo-welt

  31. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Переходите по ссылке ниже – https://corpogift.bg/koleden-podarak

  32. Этот интересный отчет представляет собой сборник полезных фактов, касающихся актуальных тем. Мы проанализируем данные, чтобы вы могли сделать обоснованные выводы. Читайте, чтобы узнать больше о последних трендах и значимых событиях!
    Провести детальное исследование – https://www.smartpc.sk/faq/ut-wisi-enim-ad-minim-veniam-quis-nostrud

  33. В этой статье представлен занимательный и актуальный контент, который заставит вас задуматься. Мы обсуждаем насущные вопросы и проблемы, а также освещаем истории, которые вдохновляют на действия и изменения. Узнайте, что стоит за событиями нашего времени!
    Информация доступна здесь – https://www.camillatoft.dk/2017/12/07/hello-world-2

  34. Этот информативный текст отличается привлекательным содержанием и актуальными данными. Мы предлагаем читателям взглянуть на привычные вещи под новым углом, предоставляя интересный и доступный материал. Получите удовольствие от чтения и расширьте кругозор!
    Как достичь результата? – https://winter-ing.de/2015/12/22/hallo-welt

  35. В этой статье представлен занимательный и актуальный контент, который заставит вас задуматься. Мы обсуждаем насущные вопросы и проблемы, а также освещаем истории, которые вдохновляют на действия и изменения. Узнайте, что стоит за событиями нашего времени!
    Смотри, что ещё есть – https://www.hotel-sugano.com/bbs/sugano.cgi/sosh13.pascal.ru/forum/www.skitour.su/sinopipefittings.com/e_Feedback/www.tovery.net/www.skitour.su/www.tovery.net/www.hip-hop.ru/forum/id298234-worksale/sugano.cgi?page30=val

  36. Эта публикация завернет вас в вихрь увлекательного контента, сбрасывая стереотипы и открывая двери к новым идеям. Каждый абзац станет для вас открытием, полным ярких примеров и впечатляющих достижений. Подготовьтесь быть вовлеченными и удивленными каждый раз, когда продолжите читать.
    Узнать из первых рук – https://f5fashion.vn/chi-tiet-hon-85-ve-chibi-hinh-nen-cute-cho-may-tinh

  37. Эта статья предлагает захватывающий и полезный контент, который привлечет внимание широкого круга читателей. Мы постараемся представить тебе идеи, которые вдохновят вас на изменения в жизни и предоставят практические решения для повседневных вопросов. Читайте и вдохновляйтесь!
    Исследовать вопрос подробнее – https://d-schule.com/2023/12/26/tiny-scientists-on-the-loose-preschool-science-wonders-2

  38. Эта статья предлагает уникальную подборку занимательных фактов и необычных историй, которые вы, возможно, не знали. Мы постараемся вдохновить ваше воображение и разнообразить ваш кругозор, погружая вас в мир, полный интересных открытий. Читайте и открывайте для себя новое!
    Получить дополнительную информацию – https://marmorariamk.com.br

  39. В этой статье-обзоре мы соберем актуальную информацию и интересные факты, которые освещают важные темы. Читатели смогут ознакомиться с различными мнениями и подходами, что позволит им расширить кругозор и глубже понять обсуждаемые вопросы.
    Подробнее можно узнать тут – https://vyvod-iz-zapoya-1.ru/

  40. Эта обзорная заметка содержит ключевые моменты и факты по актуальным вопросам. Она поможет читателям быстро ориентироваться в теме и узнать о самых важных аспектах сегодня. Получите краткий курс по современной информации и оставайтесь в курсе событий!
    Ознакомиться с деталями – https://vyvod-iz-zapoya-1.ru/

  41. I blog often and I seriously appreciate your information. This article has really peaked my interest. I’m going to take a note of your site and keep checking for new information about once a week. I subscribed to your Feed too.

  42. You have made some decent points there. I checked on the web for additional information about the issue and found most people will go along with your views on this web site.

    justjademakeup.com

  43. I found it while searching on Yahoo News. Do you have any suggestions on how to get listed in Yahoo News? I’ve been trying for a while but I never seem to get there! Thank you

    [url=https://swetasureka.co.in/free-download-of-1win-bookmaker-application-for-winning-betting-experience/]swetasureka.co.in[/url]

  44. “Last I measured, I was nearly eight inches, dad. Maybe more. I may be even bigger, who knows.” He answers nonchalantly.

  45. “What are you now, son?” “I am fully grown now, Father.” He says in a heated rebuttal to his father’s words.

  46. “Yeah, dad, it’s me.” He shouts over the blistering rush of the shower spray as it pelts him hotly with force. “It was a rough practice.” The pre-cum leaks, like a babbling brook, from the boy’s erect and pulsing cock, depositing its tiny droplets of juice onto the arm-hairs of his proud father. His father squeezes the nuts of his son, tighter and tighter, releasing more of the youthful essence.

  47. “You lettin’ the beard grow on your face, I see, son?” His father asks him, as his head bumps up under the chin of his towering son. “Dad! Dad!” His son says in a straining voice. “Release me?”

  48. “Then show me, father. Show me what it means, TO BE A MAN?” He says with an excitement building in his voice. [url=https://arturzasada.pl/]porn sex[/url] “What are ya now, by the way?”

  49. This is nicely said. !
    san manuel casino online play [url=https://luckyusaplay.com/#]best online casino[/url] own your own online casino

  50. You actually stated that superbly.
    gratis online casino spellen [url=https://luckyusaplay.com/#]casino online games[/url] gta online diamond casino heist scope out

  51. Cheers, I like this!
    mafia game online casino [url=https://luckyusaplay.com/#]best online us casinos[/url] vegas online casino bonus io

  52. Beneficial material. Many thanks!
    luckystar online casino login [url=https://luckyusaplay.com/#]legit online casinos[/url] online casino magyaroknak

  53. Fantastic info. With thanks!
    que juego paga mas en el casino online [url=https://usacasinomaster.com/#]new usa online casinos with no deposit bonuses[/url] instant payout online casinos

  54. Nicely put, Thank you.
    4. best online nj casinos [url=https://luckyusaplay.com/#]best online casinos that payout usa[/url] best browser for online casino

  55. You actually explained that exceptionally well.
    online casinos that accept vip preferred [url=https://usaplayerscasino.com/#]online casino gambling[/url] beginner’s guide to online casinos

  56. Cheers. I like it!
    hard rock online casino real money [url=https://usacasinomaster.com/#]best online casino games[/url] 2021 online casino no deposit bonus

  57. You definitely made your point.
    saskatchewan casino online [url=https://luckyusaplay.com/#]best online casino games[/url] pala casino nj online

  58. I do not even know how I ended up here, but I thought this post was
    great. I don’t know who you are but certainly you’re going to
    a famous blogger if you are not already 😉 Cheers!

    Stop by my homepage – eharmony special coupon code 2024

  59. Wow, superb weblog format! How long have you ever been blogging for?
    you made blogging glance easy. The entire look of
    your website is wonderful, as smartly as the content material!
    You can see similar here sklep

  60. Good post. I learn something new and challenging on websites I stumbleupon everyday.
    It’s always useful to read content from other authors
    and practice something from other websites.

    Also visit my homepage :: vpn special coupon code 2024

联系我们

联系我们

(44)07934433023

在线咨询: QQ交谈

邮箱: info@bioengx.org

关注微信
微信扫一扫关注我们

微信扫一扫关注我们

关注微博
返回顶部